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• eIF4E1功能喪失與TuMV感染癥狀加重有關(guān)

  使用帶GFP標(biāo)記的TuMV（TuMV-GFP UK1）感染三個(gè)基因型的擬南芥，分別為野生型WT,；敲除eIF4E1對(duì)CIYVV具抗性的基因型（eif4e1^KO）,；敲除eIFiso4E對(duì)TuMV具抗性的基因型（eifiso4e^KO）。使用FluorCam檢測(cè)感染14天,、21天之后擬南芥葉綠素?zé)晒庾兓ū碚魅~片衰老情況）及GFP表達(dá)情況（即TuMV病毒積累程度）,。從結(jié)果可知，eifiso4e^KO因其具備的病毒抗性,，而無(wú)明顯的病毒侵染,，性狀和葉綠素?zé)晒馑綗o(wú)明顯變化，而eif4e1^KO的GFP信號(hào)更強(qiáng),，說(shuō)明其病毒積累更多,，葉綠素?zé)晒獬上窠Y(jié)果也顯示，其感染癥狀比野生型更為明顯,，表現(xiàn)為更嚴(yán)重早衰（葉綠素?zé)晒庀陆担?、新葉發(fā)育停滯。

野生型與兩個(gè)基因敲除擬南芥植株感染TuMV-GFP UK1病毒14天,、21天后的葉綠素?zé)晒?、GFP熒光蛋白成像結(jié)果

• 基因功能驗(yàn)證：

• 恢復(fù)eIF4E1表達(dá)后，植株對(duì)TuMV的敏感性和病毒積累量恢復(fù)至野生型水平

  為了確認(rèn)eif4e1^KO對(duì)TuMV易感是否由eIF4E1缺失有關(guān),，通過(guò)構(gòu)建了兩個(gè)互補(bǔ)系eif4e1KO;eIF4E1-1和eif4e1KO;eIF4E1-2,，在感染TuMV-GFP UK1后，于17天后,，分析了它們的表型,。FluorCam成像結(jié)果表明，eif4e1KO;eIF4E1-1和eif4e1KO;eIF4E1-2的病毒易感性表現(xiàn)恢復(fù)到了與野生型相似水平,，比eif4e1^KO具有更高的TuMV抗性,，證明了eIF4E1的敲除缺失是eif4e1^KO突變體易感性和病毒積累增加的唯一原因。

左圖：野生型與兩個(gè)互補(bǔ)恢復(fù)系植株感染病毒17天后的葉綠素?zé)晒?、GFP熒光蛋白成像結(jié)果,；

右圖：野生型與兩個(gè)基因編輯植株感染病毒17天后的葉綠素?zé)晒?、GFP熒光蛋白成像結(jié)果

• CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將eIF4E1轉(zhuǎn)化為抗性等位基因eIF4E1^N176K 

  研究中，模擬豌豆eIF4E等位基因中與抗馬鈴薯病毒屬相關(guān)的自然突變基因,，通過(guò)基因編輯的方法獲得非轉(zhuǎn)基因的eIF4E1^N176K植株,，侵染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明，該基因編輯株對(duì)TuMV無(wú)超敏反應(yīng),，且保留對(duì)ClYVV的抗性,。 

  結(jié)合研究中的其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出結(jié)論,，敲除eIF4E1雖賦予植株ClYVV的抗性,，但卻引發(fā)了對(duì)TuMV的過(guò)度敏感。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)模擬天然抗性等位基因是更優(yōu)策略,，既可維持抗性,，又避免對(duì)其他病毒的易感性。研究強(qiáng)調(diào)基因敲除抗性育種存在潛在風(fēng)險(xiǎn),，而功能性等位基因編輯更具應(yīng)用前景,。

• FluorCam多光譜熒光成像助力葉片衰老和病毒感染程度檢測(cè)

  作為研究中的主要檢測(cè)手段，F(xiàn)luorCam提供了多方面的數(shù)據(jù)支撐,。葉綠素?zé)晒獬上窠Y(jié)果體現(xiàn)了葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度變化量化葉片衰老進(jìn)程,，直觀反映病毒感染引發(fā)的早衰現(xiàn)象，從而反映葉片衰老,。得力于系統(tǒng)非侵入性檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)追蹤植株生理狀態(tài)，避免傳統(tǒng)取樣對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾和珍貴樣品的破壞,。而系統(tǒng)具備的GFP熒光蛋白檢測(cè)則為可視化病毒分布,、量化病毒積累提供、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)感染不同階段病毒與宿主互作的時(shí)序性變化提供了可靠數(shù)據(jù),。FluorCam兼具的兩項(xiàng)技術(shù)共同為擬南芥抗病毒分子生物學(xué)研究提供了高效,、直觀的表型和分子水平分析工具。

參考文獻(xiàn)：

Zafirov, Delyan, et al. "When a knockout is an Achilles’ heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana."Molecular Plant Pathology, 22.3 (2021): 334-347.