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FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)

 

 

  FKM（Fluorescence Kinetic Microscope）多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)是目前功能最為強(qiáng)大全面的植物顯微熒光研究?jī)x器,，是基于FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的顯微成像定制系統(tǒng),。它由包含可擴(kuò)展部件的增強(qiáng)顯微鏡、高分辨率CCD相機(jī),、激發(fā)光源組,、光譜儀,、控溫模塊以及相應(yīng)的控制單元和專(zhuān)用的工作站與分析軟件組成,。它不僅可以進(jìn)行微藻、單個(gè)細(xì)胞,、單個(gè)葉綠體乃至基粒-基質(zhì)類(lèi)囊體片段進(jìn)行Fv/Fm,、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、熒光淬滅,、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線,、QA再氧化等各種葉綠素?zé)晒饧癕CF多光譜熒光（multicolor fluorescence）成像分析,；還能通過(guò)激發(fā)光源組進(jìn)行進(jìn)行任意熒光激發(fā)和熒光釋放波段的測(cè)量，從而進(jìn)行GFP,、DAPI,、DiBAC4、SYTOX,、CTC等熒光蛋白、熒光染料以及藻青蛋白,、藻紅蛋白,、藻膽素等藻類(lèi)特有熒光色素的成像分析；更可以利用光譜儀對(duì)各種熒光進(jìn)行光譜分析,，區(qū)分各發(fā)色團(tuán)（例如PSI和PSII及各種捕光色素復(fù)合體等）并進(jìn)行深入分析,。

  FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)使熒光成像技術(shù)真正成為光合作用機(jī)理研究的探針，使科研工作者在藻類(lèi)和高等植物細(xì)胞與亞細(xì)胞層次深入理解光合作用過(guò)程及該過(guò)程中發(fā)生的各種變化,，為直接研究葉綠體中光合系統(tǒng)的工作機(jī)理提供了最為有力的工具,。FKM作為藻類(lèi)/植物表型和基因型顯微研究的雙重利器，得到了學(xué)界的廣泛認(rèn)可并取得了大量的科研成果,。

 

功能特點(diǎn)

• 內(nèi)置現(xiàn)今葉綠素?zé)晒庋芯康娜砍绦?，如Fv/Fm、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng),、熒光淬滅,、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線、QA再氧化等,，可獲得70余項(xiàng)參數(shù)
• 配備10倍,、20倍、40倍,、63倍和100倍專(zhuān)用生物熒光物鏡,，可以清晰觀測(cè)到葉綠體及其發(fā)出的熒光
• 激發(fā)光源組中包括紅外光、紅光,、藍(lán)光,、綠光、白光,、紫外光和遠(yuǎn)紅光等,，通過(guò)紅藍(lán)綠三色光還可以調(diào)出可見(jiàn)光譜中的任何一種色光，能夠研究植物/藻類(lèi)中任何一種色素分子或發(fā)色團(tuán)
• 可進(jìn)行GFP,、DAPI,、DiBAC4、SYTOX,、CTC等熒光蛋白,、熒光染料的成像分析
• 高分辨率光譜儀能夠深入解析各種熒光的光譜圖
• 控溫系統(tǒng)可以保證實(shí)驗(yàn)樣品在同等溫度條件下進(jìn)行測(cè)量，提高實(shí)驗(yàn)精度，也可以進(jìn)行高溫/低溫脅迫研究

 

 

應(yīng)用領(lǐng)域

• 微藻,、大型藻類(lèi)/高等植物的單個(gè)細(xì)胞,、單個(gè)葉綠體、基粒-基質(zhì)類(lèi)囊體片段等的顯微結(jié)構(gòu)植物光合生理研究
• 藻類(lèi)/植物逆境研究
• 生物和非生物脅迫的研究
• 藻類(lèi)/植物抗脅迫能力及易感性研究
• 突變體篩選及光合機(jī)理研究
• 藻類(lèi)長(zhǎng)勢(shì)與產(chǎn)量評(píng)估
• 藻類(lèi)特有色素與光合作用關(guān)系
• 藻類(lèi)/植物——微生物交互作用研究
• 藻類(lèi)/植物——原生動(dòng)物交互作用研究
• 基因工程與分子生物學(xué)研究

 

 

測(cè)量樣品

• 植物活體切片
• 植物表皮
• 植物細(xì)胞
• 綠藻,、藍(lán)藻等各種單細(xì)胞和多細(xì)胞微藻
• 葉綠體提取液
• 類(lèi)囊體提取液
• 含有葉綠體的原生動(dòng)物

 

工作原理

  FKM分析過(guò)程中,，通過(guò)連接在顯微鏡上的激發(fā)光源組和內(nèi)置在6位濾波輪中的一系列濾波器、分光鏡激發(fā)植物樣品中各種發(fā)色團(tuán)的動(dòng)態(tài)熒光,。樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)顯微鏡放大后進(jìn)行熒光光譜分析和熒光動(dòng)力學(xué)成像分析,。SM 9000光譜儀通過(guò)光纖與顯微鏡連接，以進(jìn)行激發(fā)熒光光譜分析,。安裝在顯微鏡頂部的高分辨率CCD相機(jī)則用于熒光動(dòng)力學(xué)成像分析,。全部工作過(guò)程通過(guò)工作站和控制單元按照預(yù)先設(shè)定好的程序自動(dòng)進(jìn)行。測(cè)量過(guò)程中,，可通過(guò)溫控模塊調(diào)控藻類(lèi),、植物細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)樣品的溫度。蠕動(dòng)泵可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)藻類(lèi)的連續(xù)測(cè)量,。

 

儀器組成

 1 增強(qiáng)顯微鏡

 2 高分辨率CCD相機(jī)

 3 激發(fā)光源組

 4 SM 9000光譜儀

 5 主控制單元

 6 工作站及軟件

 7 控溫模塊的控制單元

 8 位濾波輪

 

 

技術(shù)參數(shù)

 

測(cè)量參數(shù)

• Fo, Fo’, Fs, Fm, Fm’, Fp, FtDn, FtLn, Fv, Fv'/ Fm', Fv/ Fm ,Fv',Ft,ΦPSII, NPQ_Dn, NPQ_Ln, Qp_Dn, Qp_Ln, qN, qP,，QY, QY_Ln, Rfd, ETR等50多個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)，每個(gè)參數(shù)均可顯示2維熒光彩色圖像
• OJIP快速熒光曲線：測(cè)定分析OJIP曲線與二十幾項(xiàng)相關(guān)參數(shù)包括：Fo,、Fj,、Fi、P或Fm,、Vj,、Vi、Mo,、Area ,、Fix Area、Sm ,、Ss ,、N（QA還原周轉(zhuǎn)數(shù)量）、Phi_Po ,、Psi_o ,、Phi_Eo、Phi_Do,、Phi_pav,、ABS/RC（單位反應(yīng)中心的吸收光量子通量）、TRo/RC（單位反應(yīng)中心初始捕獲光量子通量）,、ETo/RC（單位反應(yīng)中心初始電子傳遞光量子通量）,、DIo/RC（單位反應(yīng)中心能量散失）,、ABS/CS（單位樣品截面的吸收光量子通量）、TRo/CSo,、RC/CSx（反應(yīng)中心密度）,、PI_ABS（基于吸收光量子通量的“性能”指數(shù)或稱(chēng)生存指數(shù)）、PIcs（基于截面的“性能”指數(shù)或稱(chēng)生存指數(shù)）等（選配）
• GFP,、DAPI,、DiBAC4、SYTOX,、CTC等熒光蛋白和熒光染料的成像分析（選配）
• QA再氧化動(dòng)力學(xué)曲線（選配）
• Spectrum熒光光譜圖（選配）

 

具備完備的自動(dòng)測(cè)量程序（protocol）,，可自由對(duì)自動(dòng)測(cè)量程序進(jìn)行編輯

• Fv/Fm：測(cè)量參數(shù)包括Fo，F(xiàn)m,，F(xiàn)v,，QY等
• Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)：Fo,，F(xiàn)p,，F(xiàn)v，F(xiàn)t_Lss,，QY,，Rfd等熒光參數(shù)
• 熒光淬滅分析：Fo，F(xiàn)m,，F(xiàn)p,，F(xiàn)s，F(xiàn)v,，QY,，ΦII，NPQ,，Qp,，Rfd，qL等50多個(gè)參數(shù),，2套制式程序
• 光響應(yīng)曲線LC：Fo,，F(xiàn)m，QY,，QY_Ln,，ETR等熒光參數(shù)
• Dyes & FPs穩(wěn)態(tài)熒光成像測(cè)量
• OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)分析：Mo（OJIP曲線初始斜率）、OJIP固定面積,、Sm（對(duì)關(guān)閉所有光反應(yīng)中心所需能量的量度）,、QY、PI等26個(gè)參數(shù)（選配）
• QA再氧化動(dòng)力學(xué)（選配）
• Spectrum熒光光譜分析（選配）

 

熒光激發(fā)光源：

• 紅外光,、紅光,、橙光,、藍(lán)光、綠光,、白光,、紫外光等可選
• 可根據(jù)客戶要求定制光源組

 

透射光源（選配）：白光、遠(yuǎn)紅光

 

高分辨率TOMI-2 CCD傳感器：

• 逐行掃描CCD
• 最高圖像分辨率：1360×1024像素
• 時(shí)間分辨率：在最高圖像分辨率下可達(dá)每秒20幀
• A/D 轉(zhuǎn)換分辨率：16位（65536灰度色階）
• 像元尺寸：6.45μm×6.45μm
• 運(yùn)行模式：1）動(dòng)態(tài)視頻模式,，用于葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)量,；2）快照模式，用于GFP等熒光蛋白和熒光染料測(cè)量
• 通訊模式：千兆以太網(wǎng)

 

顯微鏡：Axio Imager M2,，可選配Axio Scope A1簡(jiǎn)潔版或Axio Imager Z2高級(jí)版

• 物鏡轉(zhuǎn)盤(pán)：研究級(jí)7孔自動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)盤(pán)
• 透射光快門(mén)
• 聚光器 Achr Apl 0.9 H
• 6位反光鏡轉(zhuǎn)盤(pán)
• 雙目鏡筒(100:0/30:70/0:100)
• 機(jī)械載物臺(tái)：75×50mm,，硬膜陽(yáng)極氧化表面
• 樣品架：76×26mm

 

物鏡：10倍、20倍,、40倍,、63倍和100倍專(zhuān)用生物熒光物鏡（可選）

 

6位濾波輪：葉綠素?zé)晒狻FP/SYTOX,、DAPI/CTC等

 

SM9000光譜儀

• 入射狹縫：70μm×1400μm
• 光柵：平場(chǎng)型校正
• 光譜范圍：200-980nm
• 波長(zhǎng)絕對(duì)精確度：<0.5nm
• 再現(xiàn)性：<0.1nm
• 溫度漂移：<0.01nm/K

 

溫度調(diào)控模塊：溫度調(diào)節(jié)范圍為環(huán)境溫度（室內(nèi)溫度）至70℃,，精確度0.1℃

 

蠕動(dòng)泵（選配）：流速10-5600μl/min，用于藻類(lèi)連續(xù)培養(yǎng)測(cè)量

 

FluorCam葉綠素?zé)晒獬上穹治鲕浖δ埽壕週ive（實(shí)況測(cè)試）,、Protocols（實(shí)驗(yàn)程序選擇定制）,、Pre–processing（成像預(yù)處理）、Result（成像分析結(jié)果）等功能菜單

 

 

• 客戶定制實(shí)驗(yàn)程序協(xié)議（protocols）：可設(shè)定時(shí)間（如測(cè)量光持續(xù)時(shí)間,、光化學(xué)光持續(xù)時(shí)間,、測(cè)量時(shí)間等）、光強(qiáng)（如不同光質(zhì)光化學(xué)光強(qiáng)度,、飽和光閃強(qiáng)度,、調(diào)制測(cè)量光等），具備專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)程序語(yǔ)言和腳本,，用戶也可利用Protocol菜單中的向?qū)С绦蚰０孀杂蓜?chuàng)建新的實(shí)驗(yàn)程序
• 自動(dòng)測(cè)量分析功能：可設(shè)置一個(gè)實(shí)驗(yàn)程序（Protocol）自動(dòng)無(wú)人值守循環(huán)成像測(cè)量,，重復(fù)次數(shù)及間隔時(shí)間客戶自定義，成像測(cè)量數(shù)據(jù)自動(dòng)按時(shí)間日期存入計(jì)算機(jī)（帶時(shí)間戳）
• 快照（snapshot）模式：通過(guò)快照成像模式,，可以自由調(diào)節(jié)光強(qiáng),、快門(mén)時(shí)間及靈敏度得到清晰突出的植物樣本穩(wěn)態(tài)熒光和瞬時(shí)熒光圖片
• 成像預(yù)處理：程序軟件可自動(dòng)識(shí)別多個(gè)植物樣品或多個(gè)區(qū)域，也可手動(dòng)選擇區(qū)域（Region of interest,，ROI）,。手動(dòng)選區(qū)的形狀可以是方形、圓形,、任意多邊形或扇形,。軟件可自動(dòng)測(cè)量分析每個(gè)樣品和選定區(qū)域的熒光動(dòng)力學(xué)曲線及相應(yīng)參數(shù)，樣品或區(qū)域數(shù)量不受限制（>1000）
• 數(shù)據(jù)分析模式：具備“信號(hào)計(jì)算再平均”模式（算數(shù)平均值）和“信號(hào)平均再計(jì)算”模式,，在高信噪比的情況下選用“信號(hào)計(jì)算再平均”模式,，在低信噪比的情況下選擇“信號(hào)平均再計(jì)算”模式以過(guò)濾掉噪音帶來(lái)的誤差
• 輸出結(jié)果：高時(shí)間解析度熒光動(dòng)態(tài)圖,、熒光動(dòng)態(tài)變化視頻、熒光參數(shù)Excel文件,、直方圖,、不同參數(shù)成像圖、不同ROI的熒光參數(shù)列表等

 

葉綠素?zé)晒馀c光譜分析結(jié)果

 

忍冬葉片橫切熒光成像——柵欄組織和海綿組織                  硅藻附生的紫菜表面熒光成像——細(xì)胞內(nèi)的葉綠體分布

 

                鳶尾表皮細(xì)胞熒光成像——?dú)饪着c葉綠體                                    衣藻熒光成像

 

                  玉米表皮細(xì)胞熒光成像                                            葉綠素?zé)晒夤庾V分析

 

典型應(yīng)用

 

              藻類(lèi)病害(Gachon C, et al. 2006)                      藻類(lèi)異形胞光合生理與變化過(guò)程 (Ferimazova N, et al. 2013)

 

    藻類(lèi)特有不同光合色素蛋白復(fù)合體的熒光成像與分析（Andresen, et al. 2010）        重金屬脅迫對(duì)藻類(lèi)/植物的影響(Thomas G, et al. 2016)

                                                   

 

  藍(lán)藻光合與固氮的時(shí)空隔離(Berman-Frank I, et al. 2001)             植物/藻類(lèi)光合作用機(jī)制的深入研究(Vacha F, et al. 2007.)

 

          單個(gè)細(xì)胞\葉綠體熒光動(dòng)力學(xué)與表型分析（Jacobs M, et al. 2016.）                OJIP快速熒光曲線和QA再氧化動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)量

 

               C4植物玉米花環(huán)結(jié)構(gòu)光合特性分析                                      熒光蛋白與熒光染料顯微成像

 

產(chǎn)地：捷克

 

參考文獻(xiàn)：

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 2）Ashraf N, et al. 2021. Effect of nanomolar concentrations of lanthanum on Desmodesmus quadricauda cultivated under environmentally relevant conditions. Aquatic Toxicology 235: 105818

 3）Umeki M, et al. 2020. Fecal pellets of giant clams as a route for transporting Symbiodiniaceae to corals. PLoS ONE 15(12): e0243087

 4）Morina F, & Küpper H. 2020. Direct inhibition of photosynthesis by Cd dominates over inhibition caused by micronutrient deficiency in the Cd/Zn hyperaccumulator Arabidopsis halleri. Plant Physiology and Biochemistry. DOI:10.1016/j.plaphy.2020.07.018

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 10）Kupper H, et al. 2018. Analysis of OJIP chlorophyll fluorescence kinetics and QA re-oxidation kinetics by direct fast imaging. Plant Physiology, pp.00953.2018.